واگنش
لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 6
واکنش زنجیره پلیمراز PCR
By سحر میرشاهی | On December 9, 2006 | In علوم کشاورزی | Rated
آرش جوانمردمسئله اصلی در بررسی یک ژن خاص مشکل هدف گیری آن در یک ژنوم پیچیده که ممکن است بیش از صد هزار ژن داشته باشد است. بسیاری از روشها در ژنتیک ملکولی به این مشکل فائقآمدهاند. تکنیکPCR در اواسط دههِ 1980 در دپارتمان ژنتیک انسانی بوسیلهِKaru Mullis ابداعو برای تکثیر ژن کم خونی داسی شکل و بتاگلوبین انسانی مورد استفاده قرار گرفتSaiki(1985) از پژوهشگران شرکت مهندسی ستوساشکالات موجود را رفع کرد وروش متداول کنونی را ابداع نمود.
حقوق تجاری این اختراع اینک به شرکت هافمن - روچت تعلق داردKaru Mullis در سال 1993 موفق به کسب جایزهِ نوبل شیمی گردید. واکنش زنجیرهِ پلی مراز یکروش آزمایشگاهی است که به منظور تولید انبوه قطعه خاص و انتخابی ازDNA به کار میرود.واکنش مبتنی بر تکثیر آنزیمی قطعهای ازDNA است که با استفاد از دو آغازگر چند نوکلئوتیدی که مکمل پایانهِ َ5 هر دو رشته مورد نظر هستند، صورت میگیرد تا کپی شدن الگویDNA توسط آنزیم پلیمراز امکانپذیر شود در سال 1985 تنها سه مقاله علمی در زمینهPCR گزارش شده بود. پنج سال بعد از آن این روش در هزاران آزمایشگاه استفاده گردید و تاکنون هزارانمقاله و دهها کتاب مستقل به این موضوع اختصاص داده شده است به گونهای که دانشگاه آکسفوردحتی مجلهای به نامPCR منتشر میسازد .به عقیده بیولوژیستهاPCRوسیلهای است که سوزنی را در کوهی از کاه پیدا میکند.PCR از نظر اصولی عملی تشابه زیادی به همانند سازیDNA دارد و در واقع برگرفته از آن استبطورکلی دو فرق بینPCR و همانندسازی وجود دارد: همانند سازی در بدن در دمایc 37با آنزیمDNA پلی مراز و آنزیمهای دیگر صورت میگیرد درPCRبه علت نیاز به درجه حرارت بالا جهتواسرشت شدن از آنزیم مقاوم به حرارت همانندTaqاستفاده میشود و به جای سایر آنزیمها ازتغییرات درجه حرارت استفاده میشود.مقایسه تکثیر ژن از طریق کلونینگ باPCR - در کلونینگ هفتهها یا ماهها وقت برای تکثیر قطعهDNA لازم است، در حالیکه درPCR قطعات خاصDNA از ژنومی پیچیده، ظرف چند ساعت بدست میآید.- درPCRمقادیر بسیار کمی ازDNAبرای تکثیر موردنیاز است درحالیکه در روشهای استاندارد کلونینگ وتجزیه وتحلیلهای بیولوژی ملکولی به چند میلیون قطعه ازDNAاحتیاج است. - برای کلون کردن،DNAتا حد امکان باید خالص باشد ولی برایPCR خلوصDNAاهمیت زیادی ندارد - تکثیرDNAدرPCRدر محیط عاری از سلول صورت میگیرد ولی کلونینگ به سلولهای زنده نیاز دارد.- یکی از مزایایPCR سرعت آن است پلیمرازTaqمیتواند توالیهایی متجاوز از هزارجفت باز را در ظرف مدت کمتر از یک دقیقه تکثیر نماید.- درPCRنیازی به جدا کردن قطعه مورد نظر از محل استقرارش در DNAنمیباشدحالیکه این محدودیت در روشهای کلونینگ وجود دارد.اصول و مبانیPCR واکنش زنجیره پلیمراز مبتنی بر تکثیر آنزیمی قطعهای ازDNA است که با استفاده ازآغازگر صورت میگیرد. طول آغازگر بایستی به اندازهِ کافی بزرگ باشد تا توالیهای مشابه به آنها درنواحی غیر هدف یافت نگردد پرایمرها دو عمل را انجام میدهند.اندازه قطعات تکثیر شونده را مشخص میکنند،محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص میکنند.بعد از اتصال آغازگر به مکملهای خود در توالی هدف، انتهای هیدروکسیل َ3 آنها رو به سوی ناحیه هدف قرار میگیرد.PCR طی سه دورهِ متوالی واسرشت سازیرشتهِ الگو، اتصال آغازگر و بسط توسط آنزیم پلیمراز انجام میگیرد.در چرخه اول و دوم فرآوردهِ حاصل از بسط دارای طول مشخصی نیست. در چرخه سوم قطعاتی ساخته میشود که طول آنها مشخص است از چرخهِ چهارم تکثیر به صورت نمائی است پارامترهای سیکلی روشPCR بطوردستی (بوسیله حمام آبی) و هم بطور اتوماتیک و با ترموسایکلر صورت میگیرد. ابتدا با حرارت 90-94(در30 ثانیه) دو رشتهDNA از یکدیگر جدا میشود و سپس بامختصری برودتc 30-65بمدت (30ثانیه) پرایمرها به مکملهای خود درروی رشتهDNA متصلمیشوند وبه دنبال آن با رساندن دما به 57-70(5-2 دقیقه) شرایط برای گسترش پرایمرهایچسبیده بوسیلهِ آنزیم تک پلیمراز فراهم میشود.زمان شیب حرارتی یا زمانی که درجهحرارت از مقداری به مقدار دیگر عوض میشود بستگی به نوع دستگاه به کار برده شده دارد برایاطمینان از اینکه نمونهها به درجه حرارت مورد نظر رسیدهاند مدت زمان پرش حرارتی بوسیلهِاندازهگیری ترمومتر نمونه درطی یک آزمایش تکثیرانجام میشود .گرمای غیرکافی درطیمرحله واسرشت یکی ازعلتهائی است که باعث شکست در واکنشPCR میگردد استخراجDNA برایPCR نقطهِ شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی ضرورت جداسازیDNAبا کیفیت عالی است. معمولا کیفیتDNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد میکنند سنجیده میشود. بهعلت بزرگ بودن اندازهِDNAومی در پستانداران، روشهای استخراجDNA باید حداقل استرسمکانیکی را در طی استخراج ایجاد نمایند.معمولإ روشهائی که در آنها چندین شوینده همچونSDS وtritonX100 استفاده میشود.که نقش آنها لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل بهDNA میباشد. پروتئینزدائیبیشتر از طریق پروتیئنازK صورت میگیرد که این ماده در بافر لیز کننده مورد استفاده قرار میگیرد.این آنزیم در حضورSDSدر دمایc 56-65 فعالیت دارد تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشتمیشود برعکس در همین شرایط آنزیمهای دیگر مثلDNAase دناتوره میشود.متعاقب استفاده از پروتیئنازKاز ایزوپروپانول برای از بین بردن موِثر پروتئینها استفاده میشود و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز بطور موِثر از طریق کاربرد فنل و کلروفورم از بین میرودآلودگیRNA از طریق تیمار کردن نمونه با RNAase از بین میرود.در روشهای دیگر بعد از پروتئینازK از نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده میشود در استخراجDNA از هپارین برایPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارین از فعالیتTaq پلیمراز جلوگیری میکند .وجودEDTAحداقلmM 2در بافر استخراج باعث میشود که کوانزیمهای آنزیمAase DNباEDTAشلات شود و از تجزیه تصادفیDNAجلوگیری نماید.تعداد سیکلPCR :بعضی از راهنماییها برای تعداد سیکلها در مقابل غلظت الگوی آغازی چنین پیشنهاد شدهاست.طراحی آغازگر:قواعد مشخصی برای اینکه بتوان با اطمینان یک جفت پرایمر موِثر را انتخاب کرد وجودندارد. در حال حاضر پرایمر بیش از هر عامل دیگری عامل موفقیت یا شکست در یک واکنشتکثیری است. بعضی قواعد راهنماییهای مفیدی را در مورد طراحی آغازگر میکنند که ذیلاإ به آنهااشاره شده است.- طول متوسط هر پرایمر بین 18- 30جفت باز پرایمر با طول کوچک اتصال غیراختصاصی را افزایش و پرایمر بزرگتر سرعت هیبریداسیون را کم میکند مقدارG-C دو پرایمر با هم مشابه بوده و حدود 50-60 درصد باشد.- آغازگرها را باید از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.پرایمر دایمر یا آغازگر دوتائی یک تکثیر مصنوعی است که اغلب در محصولPCR مشاهده میشود و عبارتست از یک قطعهِ دو رشتهای که طول آن تقریبا به مجموع دو پرایمر نزدیک است وهنگامی مشاهده میشود که یک پرایمر توسط آنزیم پلیمراز به روی پرایمر دیگر گسترش یابدمکانیزم واقعی که چگونه پرایمر دایمر تشکیل میشود بدرستی مشخص نیست. پرایمرها با انتهایمکمل َ3 مستعد تشکیل دایمر هستند. ضعف در آنزیمTaq باعث پلیمریزاسیون مستقیم الگویغیرهدف شود. در هر حال چنانچه پرایمر دایمر بعنوان مانعی مشاهده شوند میتوان آن را تاحدودی با غلظت حداقل پرایمر و آنزیم کاهش داد.- در انتهای َ3 پرایمر باید حداقلC یاGقرار گیرد در توالیهائی پرایمرهائی که انتهای َ3 آنها غنیا زG+C میباشد احتمال اتصال اشتباهی افزایش مییابد - باید تا حد امکان از توالیهای پالیندرومیک داخل پرایمرها جلوگیری کرد.- نسبت چهار نوکلئوتید در آغازگر حتیالمقدور یکسان باشد.- آغازگر به توالی تکرار شونده ختم نشود.- دمایTm دو آغازگر نزدیک هم باشد .- حدمجاز دمای اتصال پرایمر طراحی شدهباید بین 65-55 باشد. دمای تکثیرایدهآل 62-72میباشد.درجه حرارتی که پرایمر بهDNA الگو متصل میشود به طول آغازگر و مقدارGC آن بستگی دارد برای پرایمرهای حاوی GC 50% و دارای 20 نوکلئوتید، دمای 55 درجهسانتیگراد پیشنهادمیشود برای افزایش اختصاصی عمل کردن آغازگر حتی ممکن است دماهای بالاتری هم موردنیازباشد.برای اینکه هر پرایمر با رشته الگوی خودش هیبرید شود لازم نیست که عینا و کاملا مکمل رشتهِ الگو باشد برای طراحی پرایمر اغلب از برنامههای کامپیوتری ویژه استفاده میشود فاصله بینپرایمرهایی که باDNAی هدف هیبرید میشود بطور معمول کمتر از 15 کیلو باز میباشد.در حقیقت یک کاهش اساسی در سنتز موِثر هنگامی که محصول تکثیر متجاوز ا زb 1000میشود، مشاهده میگردد. به همین دلیل طول قطعه مورد تکثیر درPCRنباید بیش ازKb3 باشد وحدمطلوب کمتر ازKb1میباشد تکثیر قطعات بسیار طویل و بالایKb 40 مقدور است اما نیاز به روشهای ویژهای دارد.دمای ذوب آغازگردمای اتصال باید بقدر کافی پایین باشد تا پرایمر وDNA الگو قادر به اتصال باشند و از سوی دیگر باید به قدر مناسب بالا باشد تا از تشکیل اتصالات غیراختصاصی جلوگیری کند. دمای اتصالاز روی شاخصی به نام درجه حرارت ذوب محاسبه میشود. دمای ذوب درجه حرارتی است که درآن نیمی از DNAبه صورت تک رشتهای درآمده است. یکی از مهمترین مشخصاتTm وابستگی آن به ترکیب بازیDNA استG. وC سه پیوند هیدروژنی و بازهای آدنین و تیمین دوپیوند هیدروژنی دارند. بنابراین هر چقدر مقدار گوانین و سیتوزین درDNAبیشتر باشدTmبیشتراست. دمای 2-1 درجه سانتیگراد کمتر ازTmکافیست که هیبریداسیون بین پرایمر وDNAی الگودر آن صورت گیرد. دمای ذوب بطور معمول از طریق فرمول سادهِ زیر نیز محاسبه میشود.
c 0Tm = ]4 * (G + C) + 2 * (A + T) برای هر پرایمر 20 نوکلئوتیدی
دو پرایمر باید طوری طراحی شوند که دارایTm یکسان باشند در غیر اینصورت درحرارت مناسب برای یک پرایمر برای جفت دیگر نامناسب خواهد بود.بسیاری از آزمایشگاهها دمای چسبیدن را از 5-3 درجه سانتیگراد زیر دمای ذوب(Tm) که طریق این فرمول محاسبه شدهاست درنظر میگیرند. از این موضوع نتیجه گرفته میشود کهپرایمرهای با طول زیاد باعث افزایش بالا رفتن اختصاصی بودن واکنش نمیشود.بعضی از محققین رابطه زیر را برای محاسبهTm پرایمر بکار میبرند.
(FA) 36/0/L) - 005(G + C) - ( 114/0 ]j+[ + 01Log)6/61 + 5/18Tm = Kcl غلظت کاتیون منو و لنتj= طول الیگو نوکلئوتیدL= فرمامید که یک افزایندهِPCRاستFA =
بطور معمولPCR در غیاب فرمامید انجام میشود بنابراین میتوان آن را از آخر فرمول حذف کرد. این فرمول برای پرایمرهای 07-41 بازی مناسب است.فرمول دیگر برای محاسبهTm پرایمر برای نوکلئوتیدهایbp 20-35 مناسب میباشدبصورت زیر است.
(Ln) 64/1 + 22Tp = که در آن( G + C ) + ( A + T ) = Ln 2 طول پرایمر وTPدمای مناسب اتصال اس
غلظت پرایمرها و روش اندازهگیری آن غلظت پرایمر بین 50/0 تا 5/0 میکرومول و حد مطلوب 6/0 - 1/0 برای یک واکنش25 میکرولیتری میباشد. غلظت بالای پرایمر باعث بسط غیراختصاصی و پرایمر- دایمر میشود.بعضی از منابع روش زیر را برای محاسبه غلظت پرایمر پیشنهاد کردهاندبرای انجام این محاسبه ابتدا لازمست که ضریب تکثیر مولی پرایمر در 260 نانومتر محاسبه شود که غلظت مولی میتواند با استفاده از فرمول زیر محاسبه شود.روش دیگر محاسبه براساسOD 4میباشد.اتصال پرایمردما و مدت زمان لازم برای اتصال پرایمر به: 1) طول پرایمر، 2) ترکیب نوکلئوتید3) غلظت پرایمر بستگی دارد.با توجه به طیف فعالیت آنزیمTaq پلیمراز که در محدوده 58-02 درجه سانتیگراد میباشددمای اتصال در محدودهِ 72-55 درجه سانتیگراد بطور معمول بهترین نتیجه را میدهد افزایشدمای اتصال بسط غیراختصاصی را در انتهای َ3 پرایمر کاهش میدهد. دمای پایین تکثیر همراه باغلظت اختصاصی بودن واکنش را کاهش میدهد بسط پرایمرمدت زمان بسط بستگی به عوامل: 1) طول توالی هدف، 2) غلظت توالی هدف و 3) دمای تکثیر دارد.بسط پرایمر بطورمعمول دردمای 72 درجه سانتیگراد انجام میشود یک زمان بسط دقیقهای در 72 درجه سانتیگراد برای فرآوردههای معادل 2 کیلو باز کافیست بافرPCR متداولترین بافرPCRکه همراه با تک پلی مراز استفاده میشود حاوی غلظت 10 برابرکه قبل از استفاده باید به نسبت (10:1) رقیق شود این بافر حاوی اجزای زیر است.برای یک واکنشPCR ، غلظتTris - Cl ،mM 05-01 میباشد KClبا غلظت در حدmM05را میتوان در مخلوط واکنش بمنظور آسان شدن اتصال پرایمر به رشته الگو اضافه کردNaCl با غلظتmM 05 یاKCl با غلظت بیش ازmM 50 اثر باز دارندگی بر روی فعالیت آنزیم تک پلی مرازدارند.غلظت منیزیمغلظت منیزیم در تکثیر اختصاصی و نیز فعالیت آنزیمTaq پلی مراز موِثر استPCR . بایستی دارای 5/0 تا 5/2 میلی مول منیزیم باشد حضورEDTAدر مقدار منیزیم اشکال ایجادمیکند غلظتMgCl2 در مخلوط نهائی واکنش میتواند متغیر باشد معمولاإ میزان بهینه آن درمحدودهِ 5-5/0 میلی مول است.یون +2Mgدو عمل انجام میدهد: اول اینکه باdNTPیک ترکیب قابل حل ایجاد میکنند،دوم فعالیتTaq پلی مراز را تحریک میکند معمولا کمبود +2Mg باعث کاهش بازده و زیادی آن باعث تکثیر غیراختصاصی میشود. آنجائی کهdNTP میتواند به +2Mgبچسبد، تعیین دقیق غلظت منیزیم به غلظتdNTPبستگیدارد در غلظت مناسب منیزیم و افزایشmM 6-4dNTP ،سرعت سنتز تک پلی مراز 30-20 درصدکاهش مییابد.دیاکسی نوکلئوزیدتری فسفاتهاdNTP))dNTP به دو صورت منفرد یا مخلوطی از چهارdNTPتهیه میشودpH . اکثر محلولهایاستوک باNaOHبه 5/7 رسانده میشود.PCRمعمولا با غلظت حدود میلیمول،dNTP100 انجام میگیرد اما غلظت مناسبdNTP بستگی به غلظتMgCl2، غلظت پرایمر، طول محصول تکثیر شده و تعداد سیکلهایPCRدارند. محلولهای پایهdNTPدر 20- درجه سانتیگراد نگهداری میشود. و این محلولهای پایهdNTP باید تا 7pH=خنثی شود و از طریق اسپکتوفتومتر تعیین غلظت شوند.در کارهای مولکولی توصیه میشود که در محلول کار، از هرdNTPیک میلی مول موجودباشد برای به حداقل رساندن خطاها هرنوعdNTP باید درغلظتهای مساوی بکاربرده شوند یعنی از علل بسط غیراختصاصی غلظت کمتر از یک میکرومولdNTP یا غلظت کم یکی از بازها استترکیب دمای بالا بسط و اتصال بالای 55 درجه و غلظت پایین 50-10 میکرومولdNTP باشد.باعث بیشترین دقت در فرآوردهِ نهاییPCR میشود آنزیمهای پلیمرازDNA پلی مرازها آنزیمهائی هستند که با استفاده از منومرهای دیاکسی نوکلئوزیدتری فسفات و با الگو قرار دادن رشته اصلی ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را تسریع میکنند. ساختDNA معمولا از جهت َ5 بطرف َ3 است، زیرا پلیمریزاسیون اغلب از 5 آلفا فسفات دزکسینوکلئوتید تریفسفات بطرف پایانهِ 3 گروه هیدروکسیل رشتهDNA استDNA . پلی مراز برخلافRNA پلیمراز نیاز به قطعهDNA کوچک یا پرایمر برای چسبیدن به توالی مکمل دارد DNA پلی مرازها قادر به تکثیر قطعاتی با حداکثر 004 جفت باز میباشند و در دماهای بالاعلت حساس بودن این آنزیم نسبت به دما باید مرتباإ پلیمراز جدیدی اضافه شود. این نحوه عملسرعت و دقت عمل را پایین میآورد.DNA پلیمراز تگ حسن این نوعDNA پلی مراز درجه حرارت بالا (59-09 درجه سانتیگراد) آن است. علاوه بر این آنزیم تک میتواند قطعاتDNA به طول 10 هزار جفت را تکثیر کند.استفاده ازDNA پلیمراز مقاوم به حرارت حاصل از باکتری ترموس آکواتیکوس که منشاءچشمه آب گرم پارک ملی یلواستون میباشد باعث ساده و خودکار شدن واکنش میشود. پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت موجب شدهاند که بسط اختصاصی فرآوردهPCR بخاطر اتصال وبسط آغازگر در دمای بالا افزایش یابد.دمای مناسب برای فعالیت این آنزیم با توجه به الگویDNA ، برابر 80-75 درجه سانتیگراداست. در دمای 07 درجه سانتیگراد بیش از 65 نوکلئوتید در ثانیه پلی مریزه میشود. غلظت آنزیمغلظت توصیه شده برای تگ پلیمراز بین 5/2-1 واحد در صد میکرو لیتر واکنش توصیه شده است. در صورتیکه غلظت آنزیم بسیار بالا باشد، فرآوردههای زمینهای غیراختصاصی افزایشمییابد و پایین بودن بیش از حد غلظت نیز باعث کم شدن فرآوردههای مورد نظر میشود. برایتکثیرDNAژنومی یک غلظت بهینه ازTaq معمولا حدود 4-1 واحد درصد میکرو لیتر واکنشتوصیه میشود.اختصاصی بودن واکنش آنزیم مناسب و کنترل عواملی از جمله غلظت آنزیم، غلظت قطعات آغازگر، همانندسازیدرجه حرارت دقیق و زمان نگهداری محیط عمل در یک درجه حرارت معین و تعداد چرخه در هرآزمایش همه در اختصاصی بودن واکنش اثر میگذارند.بطور کلی عواملی که در کارآییPCR ایفای نقش میکنند عبارتند از:غلظتMgCl2 ، کیفیت و کمیتDNA الگو، بافرPCR، غلظتdNTP، افزایندههایPCR،بازدارندههایPCR ،Nested PCR،PCR با شروع داغ، تعداد سیکلPCR و دمای اتصالپرایمر مهار کنندهها و افزایش دهندههایPCR مواد لیست شده در جدول ذیل میتوانند درPCR حاوی نقش باشند.ژلاتین یا آلبومین سرم100 نانوگرم در 50 میکروگرم واکنشفرمامید5%، دیمتیل سولفوکساید(DMSO) 01-2%پیروفسفاتازواکنشواحد 100/0 – 01،تترامتیل آمونیوم کلراید(TMAC) 001-01 میکرومول پلیاتیلن گلایکول 000651-5 درصد،گلیسرول5-1 درصد،توین 025/2-1 درصد،پروتئین ژن 232 نانومول،7 دیاَز - َ2dGTP-با 57% جایگزین،پروتئین تک رشتهDNA 1واحد،کلیباسیل 1 واحد، بتائین5 میکروگرم در میلیلیتر، ژلاتین یا آلبومن سرم حیوانی به غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر و شوینده غیریونی مانندتوین 02 یا Laurth-21 (1/0 تا 50/0) درصد برای ثبوت پایداری آنزیم اضافه میشود.DMSO ساختمان ثانویهDNA هدف را کاهش میدهد. آزمایشات نشان داد. بطور سطحی اثر بازدارندگی بر رویTaq داشته و باعث کاهش بازده کل شده است. شویندههایغیریونی نظیرTritonX100 و توین20 تا غلظت 5% مهار کننده نیست شویندههای یونی مانندسدیم دودسیل سولفات(SDS) فقط در غلظتهای
سایر محصولات :
واگنش واگنش ...
تحقیق در مورد اطلاعاتی راجع به کامپیوتر و زبانهای برنامه نویسی 26 ص تحقیق در مورد...
هیدرولیک و پنوماتیک 4ص هیدرولیک و پنوماتیک 4ص...
تحقیق در مورد اصول 37 ص تحقیق در مورد اصول 37...
هواپیمای سمپاش 10 ص هواپیمای سمپاش 10 ص...
تحقیق در مورد اسفنج ها تحقیق در مورد اسفنج ها...
همه چیز در مورد خازن همه چیز در...
تحقیق در مورد پروژه ارزیابی کار و زمان مطالعه روش و زمانسنجی تحقیق در مورد پروژه ارزیابی کار...
همنشینی سینما و فلسفه همنشینی سینما و...
تحقیق در مورد استفاده از پاورپوینت درکلاس کتابخانه ای 22 ص تحقیق در مورد استفاده...
همسفر آزاری همسفر آزاری...
تحقیق در مورد استفاده از زئولیت در صنعت پرورش طیور 28 ص تحقیق در مورد...
همسر آزاری کامل همسر آزاری کامل...
هلو هلو...
تحقیق در مورد ازدواج و طلاق 19 ص تحقیق در مورد...
نیروگاه هسته ای نیروگاه هسته ای...
تحقیق در مورد ارزش مدیریت استراتژیک52 ص تحقیق در مورد ارزش مدیریت...
نیروگاه حرارتی نیروگاه حرارتی...
تحقیق در مورد ارائه یک الگوی امنیتی برای شبکه های کامپیوتری تحقیق در مورد ارائه...
نگهداری هویج در سرد خانه نگهداری هویج در سرد...
نگهداری سیب در سردخانه نگهداری سیب در سردخانه...
تحقیق در مورد اجزای سیستم های RFID 19 ص تحقیق در مورد اجزای سیستم های RFID...
نگهداری زرد آلو در سرد خانه نگهداری زرد آلو در سرد خانه...
تحقیق در مورد آیش بندی و تناوب زمین 27 ص تحقیق در مورد آیش...
نگهداری گیلاس پیوندی و گیلاس مشهد در سردخانه نگهداری گیلاس پیوندی...
نگرشی بر آسیب شناسی ازدواج نگرشی بر آسیب شناسی...
تحقیق در مورد آنچه از جوشکاری باید بدانیم 35 ص تحقیق در مورد آنچه از جوشکاری...
نگاهی به مبحث «درزها» در کفسازی 18 ص نگاهی به مبحث «درزها»...
تحقیق در مورد آنتن های هوشمند 23 ص تحقیق در مورد آنتن های هوشمند...
نگاهی به فقر و فقرزدایی از دیدگاه اسلام نگاهی به فقر و فقرزدایی از دیدگاه...
نگاهی به سیاهچاله نگاهی به سیاهچاله...
تحقیق در مورد آموزش Word 2003 63 ص تحقیق در مورد آموزش Word...
نکات کاربردی در مدیریت تغذیه ای گاو های شیری نکات کاربردی در مدیریت تغذیه...
تحقیق در مورد آنتروپی 12 ص تحقیق در مورد آنتروپی 12 ص...
نیشکر 20 ص نیشکر 20 ص...
تحقیق در مورد آمار بررسی بین اوقات فراغت وعمل کرد دانش آموزان در مدرسه وخانه 20 ص تحقیق در مورد آمار بررسی...
نیروهای الکتریکی و مغناطیسی 52ص نیروهای الکتریکی و مغناطیسی...
تحقیق در مورد آشنایی با حسابداری تحقیق در مورد آشنایی با حسابداری...
نوپدیدی و بازپدیدی بیماری ها نوپدیدی و بازپدیدی بیماری ها...
نور نور...
تحقیق در مورد آزمایشات عمران 17 ص تحقیق در مورد آزمایشات...
نور و امواج الکترومغناطیس نور و امواج الکترومغناطیس...
تحقیق در مورد آجیل و خشکبار 35 ص تحقیق در مورد آجیل و خشکبار...
نور آینه عدسی 21ص نور آینه ...
تحقیق در مورد 35 ص روان سالم تحقیق در مورد 35 ص روان سالم...
نهاد های کشور فرانسه نهاد های کشور فرانسه...
تحقیق در مورد آزادی 18 ص تحقیق در مورد آزادی 18 ص...
نهاد اجتماعی 14 ص نهاد اجتماعی 14 ص...
نماتد ساقه و پیاز stem and bulb nematode نماتد ساقه و پیاز stem...
تحقیق در مورد آر یو پی چیست ؟ 15 ص تحقیق در مورد آر ...
پرورش کرم ابریشم 13 ص تحلیل فضا های شهری کاربری درمانی ( بیمارستان) 61 ص امامت و امامان دوازده گانه 77 ص اثرات ورزش بر سلامتی بدن 34 ص سوره های قران و ترجمه برخی آیات سوره فلق سوره فاتحه سوره المائده آیه 6 12ص سوره احزاب فیوز های الکتریکی توضیحات بیشتر - دانلود حمل و نقل در چاه 19 ص حمل و نقل 18 ص حفاظت از محیط زیست 10 ص حد و پیوستگی 9 ص تک یاختهها 33 ص کلمات کلیدی :
zwnj zwnj zwnj zwnj zwnj برایzwnj صورتzwnj یzwnj گیرد است zwnj zwnj اختصاصیzwnj بودنzwnj اکنشzwnj دارد zwnj zwnj zwnj zwnj یzwnj شود یzwnj گیرد درجهzwnj سانتیگراد لیzwnj مراز لیzwnj راز درجهzwnj حرارتzwnj zwnj لیzwnj استzwnj هzwnj یzwnj بهzwnj هzwnj رایمر غلظتzwnj برایzwnj لیzwnj تکثیر درجهzwnj
